VOLUMEN I

[NOTA: preparar todas las diluciones en tubos
de plástico y usarlas dentro de la hora de su preparación;
se deben realizar al menos dos reacciones de
cada dilución.]
Etapa 1. Mezclar las diluciones de la preparación
de referencia del factor VII y de la preparación
a examinar con un volumen apropiado del reactivo
de factor de coagulación precalentado o con una
combinación de sus constituyentes separados, e
incubar la mezcla en tubos de plástico o en pocillos
de microplaca a 37 °C. Las concentraciones de los
diversos componentes durante la formación del
factor Xa deben ser las especificadas en la descripción
de los reactivos. Dejar que la activación del
factor X proceda durante un tiempo apropiado,
terminando la reacción antes de que la concentración
del factor Xa alcance su nivel máximo, con el
fin de obtener una relación lineal satisfactoria entre
dosis y respuesta. Los tiempos adecuados de activación
están normalmente entre 2 y 5 minutos, pero
se admiten desviaciones si con ellas se obtiene
mejor linealidad de la relación dosis-respuesta.
Etapa 2. Determinar el factor Xa por adición de
un reactivo precalentado que contenga el sustrato
cromogénico. Cuantificar la velocidad de liberación
del sustrato, que debe ser proporcional a la
concentración del factor Xa formado, midiendo en
un espectrofotómetro el cambio de absorbancia a
una longitud de onda apropiada por monitoreo continuo
de la absorbancia. Determinar la velocidad de
cambio de absorbancia a 405 nm continuamente por
un período de tiempo y obtener la velocidad media
del cambio de absorbancia (A/min) o detener la
reacción de hidrólisis por disminución del pH a 3,
con un reactivo tal como ácido acético (500 g por
litro) o solución de citrato 1 M tras un intervalo de
tiempo apropiado (A). Ajustar el tiempo de hidrólisis
de modo tal de alcanzar un desarrollo lineal del
cromóforo con el tiempo. En general los tiempos
de hidrólisis suelen estar entre 3 y 15 minutos, pero
se admiten variaciones si así se obtiene una mejora
en la linealidad de la relación dosis-respuesta.
Comprobar la validez del ensayo y calcular la
potencia de la preparación a examinar empleando
los métodos estadísticos habituales (ver 10. Análisis
estadístico de resultados de ensayos biológicos).
El método para determinar la actividad de factor
VIII es un ensayo cromogénico en el cual se determina
su actividad biológica como cofactor en la
activación del factor X por el factor IX activado
(factor IXa) en presencia de iones calcio y fosfolípidos.
La potencia de la preparación del factor VIII
se estima comparando la cantidad necesaria para
alcanzar una cierta velocidad de formación del
factor Xa en una mezcla de reacción que contiene
las sustancias que intervienen en la activación del
factor X y la cantidad de un Patrón Internacional o
de una preparación de referencia calibrada en Unidades
Internacionales, requerida para producir el
mismo efecto.
La Unidad Internacional es la actividad del factor
VIII de una cantidad establecida de Patrón Internacional,
que consiste en concentrado de factor
VIII humano liofilizado. La equivalencia en Unidades
Internacionales del Patrón Internacional la
establece la Organización Mundial de la Salud.
El método cromogénico consta de dos pasos
consecutivos: la activación del factor X a factor Xa
que depende del factor VIII y el clivajeenzimático
de un sustrato cromogénico específico para el factor
Xa, produciendo un cromóforo que se puede
cuantificar espectrofotométricamente. En las condiciones
adecuadas, existe una relación lineal entre
la velocidad de formación del factor Xa y la concentración
del factor VIII. El resumen del ensayo
se indica en el siguiente esquema:
Etapa 1:
Etapa 2:
a) Factor X Factor Xa
Sustrato cromogénico
Factor VIII activado
2
Factor IXa + fosfolípidos + Ca
Factor Xa
Péptido + cromóforo
En ambas etapas se utilizan reactivos que pueden
ser obtenidos comercialmente. La composición
de cada reactivo puede estar sujeta a alguna variación,
sus características esenciales se describen en
la siguiente especificación: pueden permitirse ciertas
desviaciones de esta descripción únicamente si
se ha comprobado, usando el Patrón Internacional
de factor VIII, que los resultados obtenidos no difieren
significativamente.