VOLUMEN I

[NOTA: es importante demostrar por la validación,
la adecuabilidad del kit usado, chequeando el
tiempo de generación de factor X para determinar el
tiempo necesario para alcanzar el 50 % de la generación
máxima de factor X.]
Reactivo factor de coagulación - Contiene proteínas
purificadas de origen humano o bovino.
Estas incluyen el factor X, factor IXa, y un activador
del factor VIII usualmente trombina. Estas
proteínas parcialmente purificadas, al menos hasta
el 50 %, no contienen impurezas que interfieren con
la activación del factor VIII o del factor X. La
trombina puede estar presente en su forma precursora
protrombina, siempre que su activación en el
reactivo sea suficientemente rápida para provocar la
activación completa y prácticamente instantánea del
factor VIII durante el ensayo. Los fosfolípidos se
pueden obtener de un sustrato natural o pueden
prepararse por síntesis, pero deben contener una
proporción importante, de fosfatidilserina. Los
componentes del reactivo completo suelen encontrarse
separados en al menos dos reactivos distintos,
carentes de la capacidad de formar el factor Xa por
sí solos. Uno de los reactivos contiene iones calcio
Después de la reconstitución, éstos se pueden combinar,
siempre que se pruebe que no se generan
cantidades significativas de factor Xa en ausencia
del factor VIII. En la mezcla de incubación final, el
factor VIII debe ser el único componente limitante
de la velocidad.
El segundo paso comprende la cuantificación
del factor Xa formado, empleando un sustrato cromogénico
específico para el factor Xa. Generalmente
consiste en un péptido corto derivatizado, de
entre 3 y 5 aminoácidos, unido a un grupo cromóforo.
Cuando se cliva este grupo a partir del péptido
sustrato, se produce un cambio de absorbancia a
una longitud de onda apropiada que permite su
cuantificación espectrofotométrica. El sustrato
debe contener también inhibidores apropiados para
detener la formación adicional del factor Xa (por
ejemplo agentes quelantes) y suprimir la actividad
de la trombina.
Prediluyente - Consiste de plasma de un paciente
con hemofilia A grave, o de un reactivo preparado
artificialmente que contenga suficiente factor
von Willebrand y que de resultados que no difieren
significativamente de los obtenidos empleando
plasma hemofílico en las preparaciones patrón y
problema. Los materiales prediluidos deben ser
estables durante un tiempo superior al requerido
para el ensayo.
Preparación estándar - Reconstituir el contenido
de la ampolla mediante el agregado de una cantidad
apropiada de agua; usar inmediatamente.
Realizar una dilución con suficiente cantidad de
Prediluyente para obtener una solución que contenga
entre 0,5 y 2,0 Unidades Internacionales por
mililitro. Preparar las siguientes diluciones de la
preparación estándar empleando una solución
isotónica regulada, no quelante que contenga 1 %
de albúmina humana o bovina, por ejemplo,
tris(hidroximetil)aminometano o imidazol. Preparar
preferentemente por duplicado y en forma independiente
por lo menos tres diluciones en progresión
geométrica o aritmética. Laconcentración final del
factor VIII deberá ser inferior a 0,01 UI por ml
durante el paso de formación del factor Xa.
Preparación muestra - Reconstituir el contenido
de la ampolla según se indica en el rótulo y emplear
inmediatamente. Realizar una dilución con
suficiente cantidad de Prediluyente para obtener
una solución que contenga entre 0,5 y 2,0 UI por
mililitro. Preparar las siguientes diluciones empleando
una solución isotónica regulada, no quelante
que contenga 1 % de albúmina humana o bovina,
por ejemplo, tris(hidroximetil)aminometano o imidazol.
Preparar preferentemente por duplicado y
en forma independiente por lo menos tres diluciones
en progresión geométrica o aritmética. Laconcentración
final del factor VIII en la mezcla reacción
deberá ser inferior a 0,01 UI por ml durante el
paso de formación del factor Xa.
Procedimiento - Preparar una solución blanco
que incluya todos los componentes excepto el factor
VIII. [NOTA: preparar todas las diluciones en
tubos de plástico y emplearlas inmediatamente. Se
debe realizar al menos dos replicas de cada dilución.]
Etapa 1. Mezclar las diluciones precalentadas
de la Preparación estándar y la Preparación muestra
con un volumen apropiado de Reactivo factor de
coagulación, también precalentado, o con la combinación
de sus constituyentes separados. Incubar en
tubos de plástico o en pocillos de microplaca a
37 °C. Las concentraciones de los distintos componentes
durante la formación del factor Xa deben ser
las especificadas anteriormente en la descripción de
los reactivos. Permitir que la activación del factor
X proceda durante un tiempo apropiado, terminando
la reacción (Etapa 2) cuando la concentración
del factor Xa alcance aproximadamente el 50 % del
nivel máximo. Los tiempos de activación están
normalmente entre 2 y 5 min.
Etapa 2. Determinar el factor Xapor agregado
del sustrato cromogénico precalentado. Cuantificar
la proporción de sustrato escindido, que debe ser
lineal con respecto a la concentración del factor Xa
formado, midiendo en un espectrofotómetro el
cambio de absorbancia a una longitud de onda
apropiada. Puede registrarse la absorbancia de