VOLUMEN I

2 0,2 1,1
3 0,3 1,0
4 0,4 0,9
5 0,5 0,8
6 0,6 0,7
7 0,7 0,6
8 0,8 0,5
9 0,9 0,4
10 1,0 0,3
11 1,1 0,2
12 1,2 0,1
Tres tubos Control de
células con 0 % de
- 1,3
hemólisis
Tres tubos al 100 % de
hemólisis
- 1,3 ml de agua
Agregar 0,2 ml de Eritrocitos de carnero sensibilizados
a cada tubo, mezclar e incubar a 37 °C
durante 60 minutos. Enfriar los tubos en un baño de
hielo y centrifugar a 1.000 g durante 5 minutos.
Medir la absorbancia del sobrenadante a 541 nm y
calcular el grado de hemólisis (Y) por la fórmula
siguiente:
(A c – A 1 ) / (A b – A 1 )
en la cual A c es la absorbancia de los Tubos 1 a 12,
A b es la absorbancia media de los tres tubos con
hemólisis al 100 % y A 1 es la absorbancia media de
los tres tubos sin hemólisis.
Representar una curva sobre papel doble logarítmico
con los valores de Y/(1-Y) en función al
volumen de complemento diluido en mililitros.
Hallar la ecuación de la recta que mejor ajuste al
conjunto de puntos y determinar el valor en ordenadas
que corresponda al 50 % de dosis hemolítica del
complemento donde Y/(1-Y) = 1,0. Calcular la actividad
en unidades hemolíticas (CH 50 /ml) de acuerdo
con la fórmula siguiente:
C d /5C a
en la cual C d es el valor inverso de la dilución del
complemento, C a es el volumen en mililitros del
complemento diluido que produce un 50 % de
hemólisis y 5 el factor de escala para tener en cuenta
el número de eritrocitos.
El ensayo no será válido a menos que el gráfico
sea lineal entre el 15 % y el 85 % de hemólisis y
que el valor de la pendiente esté comprendido entre
0,15 y 0,40 (preferentemente entre 0,18 y 0,30).
Ensayo de la actividad anticomplemento
Preparar una dilución del Complemento de cobayo
ya titulado con Solución reguladora gelatinabarbital
para obtener 100 CH 50 /ml. Agregar la
inmunoglobulina a examinar, ajustada a pH 7 si
fuera necesario. Preparar las mezclas siguientes de
incubación para una inmunoglobulina que contenga
50 mg por ml:
Inmunoglobulina a ser
examinada (ml)
Control de complemento
(por duplicado) (ml)
Inmunoglobulina (50 mg por ml) 0,2 —
Solución reguladora gelatina barbital 0,6 0,8
Complemento 0,2 0,2
Realizar en paralelo los ensayos sobre la inmunoglobulina
a examinar y sobre controles negativos
y positivos de AAC, preparados con inmunoglobulina
humana según las indicaciones del
prospecto que acompaña a la preparación de referencia.
Si la sustancia a examinar contiene más o
menos de 50 mg por ml de inmunoglobulina,
ajustar adecuadamente los volúmenes de la preparación
y de la Solución reguladora gelatinabarbital,
por ejemplo, utilizar 0,33 ml de una
preparación que contenga 30 mg por ml de inmunoglobulina
y 0,47 ml de Solución reguladora
gelatina-barbital para conseguir un volumen total
de 0,8 ml. Tapar los tubos e incubar a 37 °C durante
60 minutos. Agregar 0,2 ml de cada mezcla
de incubación a 9,8 ml de Solución reguladora
gelatina-barbital para diluir el complemento.
Para determinar la actividad del complemento
residual, realizar la Titulación del complemento en
cada tubo según se ha descrito anteriormente.