VOLUMEN I

Cuando se utiliza un ensayo de una única
dilución, debe monitorearse a lo largo del tiempo la
consistencia del ensayo y de la producción usando
indicadores adecuados y realizando un ensayo
completo de diluciones múltiples periódicamente,
por ejemplo cada 2 años. Para valoraciones
serológicas, los indicadores adecuados para
monitorear la consistencia del ensayo son valor
promedio y desviación estándar de los títulos
relativos de antitoxina o scores de las muestras de
suero obtenido después de la administración de una
dosis fija de la preparación de referencia, títulos de
antitoxinas de los controles ensayados (muestras de
sueros positivos y negativos), relación de los títulos
de antitoxina del suero control positivo y las
muestras de suero correspondientes a la vacuna de
referencia.
Método A. Ensayo de desafío en cobayos.
Selección y distribución de los animales para el
ensayo - Emplear en el ensayo cobayos sanos
provenientes del mismo stock, de 250 a 350 gr. de
peso. Distribuir los cobayos en no menos de 6
grupos iguales; utilizar grupos conteniendo un
número de animales suficiente para obtener
resultados que cumplan los requerimientos de
validez del ensayo. Si es necesario determinar la
ctividad de la toxina de desafío a ser utilizada,
incluir 3 grupos más de 5 cobayos como controles
no vacunados. Emplear cobayos del mismo sexo o
machos y hembras igualmente distribuidos entre los
grupos.
Selección de la toxina de desafío - Seleccionar
una preparación de toxina tetánica conteniendo no
menos de 50 veces la dosis paralítica 50 % por
mililitro. Si la preparación de la toxina de desafío
ha demostrado ser estable no es necesario verificar
la dosis paralítica para cada ensayo.
Preparación de la solución de la toxina de
desafío - Diluir, inmediatamente antes de emplear,
la toxina de desafío con un diluyente adecuado (por
ejemplo, solución salina peptonada regulada pH
7,4) para obtener una solución de toxina de desafío
estable conteniendo aproximadamente 50 veces la
dosis paralítica 50 % por ml. Cuando sea necesario,
utilizar porciones de la solución de toxina de
desafío diluida 1/16, 1/50 y 1/160 con el mismo
diluyente para determinar la actividad de la toxina.
Dilución de la muestra y de la preparación de
referencia - Preparar diluciones de la vacuna a ser
examinada y de la preparación de referencia
empleando una solución de cloruro de sodio 9 g/l de
forma tal que las diluciones formen una serie
difiriendo por no más de 2,5 veces y que las
diluciones intermedias, cuando son inyectadas
subcutáneamente a una dosis de 1.0 ml por cobayo
protejan aproximadamente el 50 por ciento de los
animales de los efectos paralíticos de la inyección
subcutánea de la cantidad de toxina tetánica
indicada para ese ensayo.
Inmunización y desafío - Asignar 1 dilución a
cada grupo de cobayos e inyectar subcutáneamente
1,0 ml de cada dilución en cada cobayo del grupo al
cual la dilución fue asignada. Después de 28 días,
inyectar subcutáneamente en cada animal 1,0 ml de
la solución de toxina de desafío (conteniendo
50 veces la dosis paralítica 50 %).
Determinación de la actividad de la toxina de
desafío - Si es necesario, asignar las 3 diluciones
realizadas a partir de la solución de toxina de
desafío, una a cada uno de los 3 grupos de 5
cobayos e inyectar subcutáneamente 1.0 ml de cada
solución en cada cobayo del grupo en el cual esa
solución fue asignada.
La actividad y la estabilidad de la toxina de
desafío se determinan realizando un número
adecuado de determinaciones de la dosis paralítica
50 %, por lo tanto no es necesario repetir la
determinación para cada ensayo.
Lectura e interpretación de los resultados -
Examinar los cobayos dos veces al día. Remover y
sacrificar todos los animales que muestren signos
definidos de parálisis tetánica. Contar el número de
cobayos sin parálisis 5 días después de la inyección
de la toxina de desafío. Calcular la potencia de la
vacuna a ser examinada relacionada a la potencia de
la preparación de referencia en base a la proporción
de animales desafiados sin parálisis en cada uno de
los grupos de los cobayos vacunados, empleando
métodos estadísticos usuales.
El ensayo sólo es válido si tanto para la vacuna
a ser analizada como para la preparación de
referencia la dosis protectiva 50 % se encuentra
entre la mayor y la menor dosis administradas a los
cobayo; cuando corresponda, el número de
animales paralizados en los tres grupos de los cinco
inyectados con las diluciones de la solución de la
toxina de desafío indican que el desafío fue
aproximadamente 50 veces la dosis paralítica 50 %;
los límites de confianza (P=0.95) son no menores
que 50 por ciento y no mayores que 200 por ciento
de la potencia estimada; - el análisis estadístico
muestra pendiente significativa y no muestra
desviación de la linealidad y del paralelismo de las
curvas dosis respuesta. El ensayo puede ser
repetido, pero si se realiza más de 1 ensayo, los
resultados de todos los ensayos válidos deben ser
combinados para la estimación de la potencia.
Método B. Ensayo de desafío en ratones
Selección y distribución de los animales para el
ensayo - Emplear ratones sanos provenientes del