VOLUMEN I

determinar si la potencia de la muestra es
significativamente mayor del mínimo requerido
pero no da información sobre la linealidad,
paralelismo y curva dosis respuesta.]
Método de desafío intradérmico
Selección y distribución de animales para el
ensayo - Utilizar en el ensayo cobayos blancos
sanos provenientes del mismo stock y de un tamaño
adecuado para el número de sitios de desafío. La
diferencia de masa corporal entre el animal más
pesado y el más liviano no debe ser mayor de 100 g.
Distribuir los cobayos en no menos de seis grupos
iguales; utilizar grupos conteniendo un número de
animales suficiente para obtener resultados que
cumplan los requerimientos para un ensayo válido
descriptos más adelante. Si la toxina de desafío a
ser utilizada no ha mostrado ser estable o no ha sido
adecuadamente estandarizada incluir 5 cobayos
como control no vacunados. Utilizar cobayos del
mismo sexo o machos y hembras igualmente
distribuidos entre los grupos.
Selección de la toxina de desafío - Seleccionar
una preparación de toxina diftérica conteniendo 67
a 133 lr/100 en 1 Lf y 25.000 a 50.000 dosis
mínimas reactivas para la piel de los cobayos en 1
Lf. Si la preparación de la toxina de desafío ha
demostrado ser estable no es necesario verificar la
actividad en todos los ensayos.
Preparación de la solución de la toxina de
desafío - Diluir inmediatamente antes de utilizar la
toxina de desafío con un diluyente adecuado para
obtener una solución conteniendo 0,0512 Lf en
0,2 ml. Preparar a partir de esta una serie de cinco
diluciones seriadas al cuarto conteniendo alrededor
de 0,0128; 0,0032; 0,0008; 0,0002 y 0,00005 Lf en
0,2ml.
Determinación de la potencia de la vacuna -
Utilizando una solución de 9 g de cloruro de sodio
por litro preparar diluciones de la vacuna en ensayo
y de la preparación de referencia, de forma tal que
para cada una, las diluciones formen una serie
difiriendo por no más de 2,5 veces y en la cual las
diluciones intermedias, cuando son inyectadas
subcutáneamente a una dosis de 1,0 ml por cobayo,
resulten en un puntaje intradérmico de
aproximadamente 3 cuando los animales son
desafiados. Asignar 1 dilución a cada grupo de
cobayos e inyectar subcutáneamente 1,0 ml de cada
dilución en cada cobayo. Después de 28 días,
afeitar ambos flancos de cada cobayo e inyectar
intradérmicamente 0,2 ml de cada una de las
6 diluciones de toxina en seis sitios separados en
cada uno de los cobayos vacunados de manera de
minimizar interferencias entre los sitios adyacentes.
Determinación de la actividad de la toxina de
desafío - Si es necesario, inyectar los animales
control no vacunados con diluciones conteniendo
80, 40, 20, 10 y 5 millones de un Lf de la toxina de
desafío.
Lectura e interpretación de los resultados -
Examinar todos los sitios de inyección 48 horas
después de la inyección de la toxina de desafío y
registrar la incidencia de eritema específico de
difteria. Registrar también el número de sitios
libres de esas reacciones como el puntaje
intradérmico de desafío. Tabular conjuntamente los
puntajes de desafío intradérmico para todos los
animales que recibieron la misma dilución de
vacuna y utilizar esos datos con una transformación
adecuada, tal como (puntaje) 2 o arcoseno
((puntaje/6) 2 ) para obtener un estimado de la
potencia relativa para cada una de las preparaciones
por análisis cuantitativo de líneas paralelas.
El ensayo sólo es válido si para la vacuna en
ensayo y la preparación de referencia, el puntaje
medio obtenido al menor nivel de dosis es menor
de 3 y el puntaje medio al mayor nivel de dosis es
mayor de 3; cuando corresponda, la dilución de la
toxina que contiene 40 millones de un Lf da un
eritema positivo en al menos 80 % de los cobayos
control y la dilución conteniendo 20 millones de un
Lf que da un eritema positivo en no menos de 80 %
de los cobayos (si este criterio no es alcanzado se
debe seleccionar una toxina diferente); los límites
de confianza (P=0.95) son no menos de 50 % y no
más de 200 % de la potencia estimada; el análisis
estadístico no debe muestrar desviación de la
linealidad y del paralelismo.
El ensayo puede ser repetido pero cuando se
realiza más de 1 ensayo los resultados de todos los
ensayos válidos deben ser combinados para la
estimación de la potencia.
Método de desafío letal
Selección y distribución de los animales para el
ensayo - Utilizar en el ensayo cobayos sanos
provenientes del mismo stock, de 250 g a 350 g de
peso. Distribuir los cobayos en no menos de 6
grupos iguales; utilizar grupos conteniendo un
número de animales suficiente para obtener
resultados que cumplan los requisitos para un
ensayo válido descriptos más adelante. Si la toxina
de desafío a ser utilizada no ha mostrado ser estable
o no ha sido adecuadamente estandarizada, incluir 4
grupos más de 5 cobayos como control no
vacunados. Utilizar cobayos del mismo sexo o
machos y hembras igualmente distribuidos entre los
grupos.
Selección de la toxina de desafío - Seleccionar
una preparación de toxina diftérica conteniendo no